PNRR SEELIFE

SEELIFE è un progetto PNRR nato con lo scopo di rafforzare la rete Italiana di Eurobioimaging (EUBI), una infrastruttura di ricerca europea che in Italia ha 4 nodi, uno dei quali è ALM (Advanced Light Microscopy), con 5 siti di cui uno a Genova, condiviso tra IIT e Dipartimento di Fisica dell’Università. L’unità di Genova è coinvolta nel WP1 (Technological empowering of the biological imaging services) ed è Leader del WP4 (Empowering training activity and dissemination).  
Lo strumento Minflux commerciale di Abberior si aggiunge ai sistemi a fluorescenza confocale Leica TCS SP5 e Leica Stellaris8 TAU STED equipaggiato con laser a luce bianca e linea multifotone, quest’ultimo acquisito nell’ambito dell’attività del DIFILAB, disponibili presso lo stesso sito.

Immagini di pori nucleari (NUP107) da linea cellulare HepG2
Immagini di pori nucleari (NUP107) da linea cellulare HepG2 acquisite con Leica Stellaris8 TAU STED: a sinistra un confronto di acquisizione in 2D in modalità confocale e STED dello stesso nucleo, a destra una ricostruzione 3D.

Specifiche tecniche Minflux:

  • microscopio ottico rovesciato Olympus IX83 con obiettivo a immersione in olio 100X 1.4 NA
  • sistema di stabilizzazione 3D del campione piezometrico con retroazione basata su identificazione di nanoparticelle di oro come marcatori di riferimento
  • laser Minflux a 640 nm, laser confocale a 405 nm

Prestazioni Minflux:

  • visualizzazione anche 3D di campioni biologici (viventi e fissati) con risoluzione migliore di 5 nm
  • tracciatura di singole molecole in cellule viventi con frequenza di campionamento fino a 10 kHz (ovvero una localizzazione ogni 100 µs) con risoluzione migliore di 20 nm

Minflux, basato sulla fluorescenza intermittente di marcatori in opportuno ambiente, consente di raggiungere la risoluzione su scala molecolare di circa 2 nm.  In questa tecnica il limite di diffrazione viene superato distinguendo le sonde fluorescenti nel tempo oltre che nello spazio, in base al principio della localizzazione già adottato per STORM/PALM, utilizzato qui in maniera intelligente grazie ad algoritmi di scansione e identificazione che consentono di spingere la super-risoluzione di un ordine di grandezza rispetto a queste tecniche.  D’altro canto, a questo livello di prestazioni diventa fondamentale la definizione di uno specifico problema biologico da studiare e la messa a punto di una preparativa specifica per i rispettivi campioni.  Ad oggi i risultati di Minflux sono limitati nella maggior parte dei casi alla visualizzazione di sistemi modello (pori nucleari  o "righelli"  di verifica della risoluzione basati su spaziatori chimici) o alla tracciatura di molecole con comportamento in gran parte noto come kinesina.
 

Immagini di pori nucleari (NUP107) da linea cellulare HepG2
NUP107 da HepG2: in alto a sinistra luce trasmessa, in alto a destra immagine confocale della zona selezionata in verde; in basso immagini di localizzazioni di singole molecole nella stessa zona: sono visibili le subunità dei pori nucleari.

Nell'ottica sia di ideare il maggior numero possibile di esperimenti utili sia di fornire un servizio come previsto dagli obiettivi del progetto, il centro di Genova si propone mettendosi a disposizione dei ricercatori Italiani di tutti i gruppi interessati, su specifica richiesta, con varie modalità (condivisione dei risultati scientifici o servizio di facility a pagamento di tariffe orientate alla manutenzione dello strumento, dipendenti dal tipo di istituto utilizzatore).  Sono in corso contatti con Abberior per fornire anche servizio di addestramento di nuovi utenti di altri centri europei.

Immagine confocale di pori nucleari (NUP107) da linea cellulare HepG2
Immagine confocale di NUP107 da cellule HepG2 acquisita con Minflux dopo diversi processi di localizzazione a singola molecola in differenti zone d’interesse selezionate nel nucleo (riquadri scuri).